微小隐孢子虫是一种人兽共感染的肠道寄生虫，可引起人类和动物中度至重度腹泻，对人类和动物的健康构成威胁。不幸的是，目前还没有有效的药物或疫苗来治疗或预防隐孢子虫对人类和动物的感染。研究者们试图通过基因组研究去优化抗隐孢子虫药物开发和疫苗设计。然而，隐孢子虫难体外培养、难大量获取制约了隐孢子虫基因组测序的发展。为了解决这一挑战，我们给出了单卵囊全基因组扩增和长读测序技术相结合的方案。
由于长读测序技术对微小隐孢子虫DNA样品浓度和纯度都有着较高的要求，这也是本研究的技术难点。前期的卵囊纯化尤为重要，我们使用密度梯度离心法和显微操作法，对微小隐孢子虫卵囊进行纯化和单卵囊挑选收集（图1）。然后，将10个卵囊样品裂解并使用REPLI-g单细胞试剂盒进行全基因组扩增。
图1：卵囊纯化和收集过程（黄色箭头：微小隐孢子虫）
本研究还建立了一套完善的微小隐孢子虫基因组拼接组装策略（图2）。我们使用高质量的扩增DNA构建基因组文库，使用Oxford nanopore technology平台和PacBio high fidelity (HiFi)平台分别进行长读测序。同时，也用MGISEQ-2000平台进行了短读测序，短读数据用于基因组拼接组装过程中碱基错误校正。
图2：微小隐孢子虫基因组组装框架
本研究最终获得了从断奶前腹泻犊牛中分离的微小隐孢子虫IIdA19G1亚型的高质量基因组组装。组装的基因组长9.13 Mb，包含8条染色体，其中6条染色体在一端或两端被端粒序列所覆盖。共预测蛋白编码基因3,915个，完整性较高，单拷贝BUSCO基因的完整性为98.2%（表1）。
表1：组装的与已发表的微小隐孢子虫参考基因组的比较
本研究是利用单卵囊全基因组扩增和长读测序技术相结合，完成了隐孢子虫物种高质量染色体水平基因组组装的尝试，这也可能为其他难以收集或不可培养病原体基因组测序项目提供有效策略。
河南农业大学动物医学院博士陈远才为本论文的第一作者，张龙现教授为论文的通讯作者，中国科学院水生生物研究所王光营博士为共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划项目(2022YFD1800200)、国家自然科学基金-河南省联合基金重点项目(U1904203)、中原千人计划领军人才项目(19CZ0122)资助。感谢万种原生生物基因组计划（P10K）联盟成员提供的有益建议。（文/陈远才 李俊强）
河南农业大学动物医学院博士陈远才为本论文的第一作者，张龙现教授为论文的通讯作者，中国科学院水生生物研究所王光营博士为共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划项目(2022YFD1800200)、国家自然科学基金-河南省联合基金重点项目(U1904203)、中原千人计划领军人才项目(19CZ0122)资助。感谢万种原生生物基因组计划（P10K）联盟成员提供的有益建议。（文/陈远才 李俊强）
